Naslov DARTS metoda proteomike u istraživanju bioloških meta erlotiniba
Naslov (engleski) DARTS method in the researching of the biological targets of erlotinib
Autor Marcela Finek
Mentor Milan Mesić (mentor)
Član povjerenstva Toni Todorovski (predsjednik povjerenstva)
Član povjerenstva Milan Mesić (član povjerenstva)
Član povjerenstva Dean Marković (član povjerenstva)
Ustanova koja je dodijelila akademski / stručni stupanj Sveučilište u Rijeci (Fakultet biotehnologije i razvoja lijekova) Rijeka
Datum i država obrane 2024-09-23, Hrvatska
Znanstveno / umjetničko područje, polje i grana BIOTEHNIČKE ZNANOSTI Biotehnologija
Sažetak Proteomika je jedna od omics metoda koja istražuje funkcije, strukture i ekspresiju svih proteina u biološkom sustavu. Ključna je za razumijevanje mehanizama bolesti, a okuplja neke inovativne tehnike poput masene spektrometrije, Western blottinga i elektroforeze. DARTS metoda (eng. Drug affinity responsive target stability) naziv je za skup tehnika proteomike koje se koriste za istraživanje bioloških meta lijekova. Princip njezinog rada počiva na činjenici da se proteini bolje odupiru digestiji proteolitičkih enzima ukoliko je za njih vezan ligand (lijek). Posebnu ulogu ima u istraživanju nepoznatih bioloških meta malih molekula koje imaju sposobnost ciljanja specifičnih proteina važnih za reguliranje unutarstaničnih signalnih puteva. Uzorci staničnih lizata se tretiraju malom molekulom, izlažu digestiji proteaze te se potom kvalitativno i kvantitativno analiziraju. Posebna prednost DARTS-a je ta što koristi lijek u svom nativnom obliku, bez potrebe modificiranja. Ova metoda koristi se za različite vrste istraživanja, a najviše za istraživanje poznatih i nepoznatih meta lijekova, mehanizama djelovanja lijekova i mehanizama rezistencije.
U ovom radu odabrana mala molekula je erlotinib (Tarceva) čija je poznata biološka meta receptor epidermalnog faktora rasta (EGFR). Erlotinib je inhibitor tirozin-kinaza te vezanjem zaustavlja proliferaciju tumorske stanice i izbjegavanje apoptoze. Uzorke za DARTS metodu, pripremili smo pomoću lizata HeLa i A431 stanica koje pretjerano izražavaju EGFR. Kao proteazni enzim kojim je provođena digestija, korišten je enzim pronaza, a proteini su razdvajani pomoću gradijentne SDS-PAGE elektroforeze, prema molekulskoj masi. Western blottingom potvrđena je specifičnost upotrebom protutijela te je povećana je osjetljivost metode što je rezultiralo boljom vizualizacijom promjene intenziteta EGFR-a za kojeg je vezan erlotinib. Potvrđeno je da je EGFR direktna meta za vezanje erlotiniba te da je njegov mehanizam rada zaustavljanje autofosforilacije i prekid signalnog puta za proliferaciju stanice. Također su istražene i nepoznate mete erlotiniba (tzv. off-tagets) koje pokazuju značajnu promjenu u intenzitetu u njegovoj prisutnosti, no one nisu identificirane. Zaključeno je da je DARTS višenamjenska, brza i jednostavna biofizikalna metoda, koja ne zahtjeva kemijske modifikacije istraživanog lijeka, te je korisna u brojnim aspektima istraživanja i razvoja lijekova.
Sažetak (engleski) Proteomics one of the omics methods that investigates the functions, structures and expression of all proteins in a biological system. It is important for understanding the disease mechanisms and brings together some innovative techniques such as mass spectrometry, Western blotting and electrophoresis. The DARTS method (Drug affinity responsive target stability) is the name of a set of proteomics techniques used to investigate the biological targets of drugs. The principle of its work is based on the fact that proteins better resist the digestion of proteolytic enzymes if a ligand (drug) is attached to them. It has a special role in the research of unknown targets of small molecules that have the ability to aim at specific proteins important for regulating intracellular signaling pathways. Samples of cell lysates are treated with a small molecule, subjected to protease digestion and then analyzed qualitatively and quantitatively. A special advantage of DARTS is that it uses the drug in its native form, without any modification. This method is used for different types of research, and mostly for research into known and unknown targets of drugs, the mechanisms of action of drugs, but also the mechanisms of resistance.
The small molecule chosen in this thesis is erlotinib (Tarceva), whose known biological target is the Epidermal growth factor receptor (EGFR). Erlotinib is a tyrosine-kinase inhibitor which stops the proliferation of tumor cells and the avoidance of apoptosis when bound. Samples for the DARTS method were prepared using lysates of HeLa and A431 cells that overexpress EGFR. Pronase was the protease enzyme used for digestion, and proteins were separated using gradient SDS-PAGE electrophoresis, according to molecular weight. Western blotting confirmed the specificity using antibodies and increased the sensitivity of the method, which resulted in a better visualization of the change in the intensity of EGFR, to which erlotinib is bound. It was confirmed that EGFR is a direct target of erlotinib, but also that its mechanism of action is stopping the autophosphorylation that interrupts the signaling pathway for cell proliferation. Unknown targets of erlotinib (off-targets), that show a significant change in intensity in its presence, were also investigated, but not identified. It was concluded that DARTS is a multipurpose, fast and simple biophysical method that does not require chemical modifications of the drug and is useful in many aspects of drug research and development.
Ključne riječi
DARTS
proteomika
protein
ligand
erlotinib
EGFR
Ključne riječi (engleski)
DARTS
proteomics
protein
ligand
erlotinib
EGFR
Jezik hrvatski
URN:NBN urn:nbn:hr:193:181195
Studijski program Naziv: Medicinska kemija Vrsta studija: sveučilišni Stupanj studija: diplomski Akademski / stručni naziv: magistar/magistra medicinske kemije (mag. med. chem.)
Vrsta resursa Tekst
Način izrade datoteke Izvorno digitalna
Prava pristupa Otvoreni pristup
Uvjeti korištenja
Datum i vrijeme pohrane 2024-09-26 08:49:50