Naslov Ex vivo expansion and phenotypic characterization of mouse primary regulatory T cells
Naslov (hrvatski) Ex vivo ekspanzija i fenotipska karakterizacija mišjih primarnih T regulatornih stanica
Autor Kristina Manzoni
Mentor Jelka Pohar (mentor)
Mentor Jelena Ban (komentor)
Član povjerenstva Jelka Pohar (član povjerenstva)
Član povjerenstva Nikolina Vidović (član povjerenstva)
Član povjerenstva Ivana Munitić (predsjednik povjerenstva)
Član povjerenstva Jelena Ban (član povjerenstva)
Ustanova koja je dodijelila akademski / stručni stupanj Sveučilište u Rijeci (Fakultet biotehnologije i razvoja lijekova) Rijeka
Datum i država obrane 2024-07-09, Hrvatska
Znanstveno / umjetničko područje, polje i grana BIOTEHNIČKE ZNANOSTI Biotehnologija
Sažetak Foxp3+ CD25+ regulatory T cells (Tregs) are a rare subset within the CD4+ T cell compartment, playing a vital role in immune system regulation. Because of their immunosuppressive ability, Tregs are an attractive potential new tool for treating autoimmune diseases and preventing graft rejection. Although the population of Treg cells is well-defined by the intracellular expression of the transcription factor Forkhead box protein 3 (Foxp3), no defined surface marker distinguishes Tregs from other T cells, making reliable phenotypic characterization and isolation challenging. Furthermore, most isolation and expansion protocols are designed for human Tregs, representing a significant drawback since mice are important model organisms in the preclinical phase of drug development. A range of methodologies was employed. Treg cells were isolated from mouse spleens using immunomagnetic separation. Consequently, cells were activated and expanded for 15 days, using different ratios of Treg cells-to-activation beads in the presence of mouse interleukin-2 (mIL-2) cytokine. After the staining for viability, surface, and intracellular markers, the
phenotype of Tregs and other T cell subsets was analyzed using flow cytometry (FC). To investigate the transcriptional profiles of subpopulations within the Tregs samples, we performed the 10x Genomics single-cell RNA sequencing (scRNA-seq). This study resulted in the successful establishment of isolation and expansion protocols for mouse Foxp3+ CD25+ Tregs, as well as comprehensive FC staining panels. The phenotype and transcriptome analysis revealed the heterogeneity of the Treg population already upon isolation from secondary lymphatic tissue. ScRNA-seq analysis provided a deeper insight into the Treg cells' transcriptome and revealed other important biomarkers for contaminants-free isolation and improved phenotypic characterization of Treg cells. The obtained results pave the way for developing innovative therapeutic approaches for autoimmune diseases, graft rejection and cancer, which hold a promise to greatly improve patients´quality of life.
Sažetak (hrvatski) Foxp3+ CD25+ regulatorne T stanice (Tregs) rijetka su podskupina CD4+ T stanica, koje igraju vitalnu ulogu u regulaciji imunološkog sustava. Zbog svojih imunosupresivnih sposobnosti, Treg su zanimljive kao potencijalno novo sredstvo za liječenje autoimunih bolesti i sprječavanje odbacivanja presatka. Iako je populacija Treg stanica dobro definirana unutarstaničnom ekspresijom transkripcijskog faktora Foxp3, ne postoji definirani površinski marker koji bi razlikovao Tregs od ostalih T stanica, što pouzdanu fenotipsku karakterizaciju i izolaciju čini izazovnom. Nadalje, većina protokola izolacije i ekspanzije dizajnirana je za ljudske Treg stanice, što predstavlja značajan nedostatak jer su miševi važni modelni organizmi u pretkliničkoj fazi razvoja lijeka. Primijenjen je niz metodologija. Treg stanice izolirane su iz slezena miševa pomoću imunomagnetske separacije. Stanice su zatim aktivirane i ekspandirane tijekom 15 dana, korištenjem različitih omjera Treg stanica i aktivacijskih kuglica u prisutnosti interleukin-2 citokina. Nakon bojanja antitijelima za vijabilnost, površinske i unutarstanične markere, fenotip Treg stanica i drugih podskupova T stanica analiziran je protočnom citometrijom. Kako bismo istražili transkripcijske profile subpopulacija unutar Treg uzoraka, izvršili smo 10x Genomics single-cell RNA sekvenciranje (scRNAseq). Ova studija rezultirala je uspješnom uspostavom protokola izolacije i ekspanzije za mišje Foxp3+ CD25+ Tregs, kao i definiranim sveobuhvatnim panelima kombinacije antitijela za protočnu citometriju. Analiza fenotipa i transkriptoma otkrila je heterogenost Treg populacije već pri samoj izolaciji iz sekundarnog limfnog tkiva.
ScRNA-seq analiza pružila je dublji uvid u transkriptom Treg stanica i otkrila druge važne biomarkere za izolaciju bez kontaminanata i poboljšanu fenotipsku karakterizaciju Treg stanica. Dobiveni rezultati otvaraju put prema razvoju inovativnih pristupa liječenju za autoimune bolesti, odbacivanje presatka i rak, koji obećavaju značajno poboljšanje kvalitete života pacijenata.
Ključne riječi
regulatory T cells
mice
protocol optimization
flow cytometry
single-cell RNA sequencing
Ključne riječi (hrvatski)
regulatorne T stanice
miševi
optimizacija protokola
protočna citometrija
single-cell RNA sekvenciranje
Jezik engleski
URN:NBN urn:nbn:hr:193:805678
Projekt Šifra: MN-0013-105 Naziv: Story of regulatory T cells told through their transcriptome Kratica: TREXCell Voditelj: Jelka Pohar Pravna nadležnost: Slovenija Financijer: ARIS
Projekt Šifra: J3-3084 Naziv: Inducible Programming of CAR T Cell Intrinsic Properties for Cancer Immunotherapy Voditelj: Anže Smole Pravna nadležnost: Slovenija Financijer: ARIS
Projekt Šifra: L4-3181 Naziv: Hierarchical DNA assembly for advanced applications in biopharmaceuticals production and cell therapy Voditelj: Marko Dolinar Pravna nadležnost: Slovenija Financijer: ARIS
Projekt Šifra: J3-4516 Naziv: Neoantigens in non small cell lung cancer Voditelj: Julij Šelb Pravna nadležnost: Slovenija Financijer: ARIS
Projekt Šifra: P1-0245 Naziv: Ecotoxicology, toxicogenomics and carcinogenesis Voditelj: Bojana Žegura Pravna nadležnost: Slovenija Financijer: ARIS
Projekt Šifra: 10ICIGEN Naziv: Immunology and Cellular Immunotherapy Lab Voditelj: Jelka Pohar, Anže Smole Pravna nadležnost: Slovenija Financijer: National Institute of Biology
Projekt Šifra: InTREGing Naziv: Vpogled v transkriptom regulatornih celic T (Treg) v ključnih stopnjah imunskega odziva Voditelj: Jelka Pohar Pravna nadležnost: Slovenija Financijer: National Institute of Biology
Projekt Šifra: 10X Challenge Naziv: Single cell profiling of regulatory T cell subsets Voditelj: Jelka Pohar Pravna nadležnost: Slovenija Financijer: Labena d.o.o.
Studijski program Naziv: Biotehnologija u medicini Vrsta studija: sveučilišni Stupanj studija: diplomski Akademski / stručni naziv: magistar/magistra biotehnologije u medicini (mag. biotech. in med.)
Vrsta resursa Tekst
Način izrade datoteke Izvorno digitalna
Prava pristupa Rad dostupan nakon Datum isteka embarga: 2029-07-09
Uvjeti korištenja
Datum i vrijeme pohrane 2024-07-18 07:42:36